商品屬性：

描述:

UvsX 重組酶，來源于 T4 噬菌體，是 RecA/Rad51家族的同源體。RecA/Rad51 重組酶家族在雙鏈 DNA 斷裂的無誤修復(fù)和復(fù)制叉重新啟動(dòng)的過程中起到重要作用。
T4 UvsX 重組酶可與其他重組酶一起錨定在單鏈 DNA 上并激活其在其他雙鏈 DNA 上尋找同源序列，以進(jìn)一步完成鏈置換。經(jīng)檢測，該酶無核酸酶活性。

儲(chǔ)存：

置于-20°C 可保存 1 年，-80°C 長期保存，短期使用置于 4°C，保存一個(gè)月，避免反復(fù)凍融。
熱失活：60°C，10min。
酶儲(chǔ)存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM
EDTA, 10% Trehalose, pH 7.5。2xRPA BufferMix：包含反應(yīng)緩沖鹽、ATP、磷酸肌酸、dNTP、PEG、DTT、BSA 等，可用于 RPA 擴(kuò)增試驗(yàn)。該試劑 4°C
條件下放置 1 個(gè)月性能無下降。
基于本蛋白進(jìn)行 RPA 反應(yīng)測試的全套試劑

用于 RPA 擴(kuò)增的測試引物與探針
CPV-F（20uM） CACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAG
CPV-R（20uM） AGTTTGTATTTCCCATTTGAGTTACACCACGTCT
Probe（10uM） CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGT[dT-BHQ1]
[THF][dT-FAM]ATAGGAGTTCAACAAG -(C3)
Canine parvovirus type 2,VP2
加入 1μl 的模板 DNA，上機(jī)反應(yīng)前加入 1.25 μl 的 280 mMMg(OAC)2（終濃度 14 mM），總反應(yīng)體積 25 μl。混合均勻，并離心，置于 39-42℃條件下反應(yīng) 30min。
2. 進(jìn)行熒光 RPA 擴(kuò)增在進(jìn)行熒光檢測時(shí)體系中，額外加入 0.3 μl 的 10μM Probe（120 nM的終濃度）和 50U 的 Exonuclease III（2U/μl 的終濃度），即可進(jìn)行熒光檢測。本方法應(yīng)用原理為 ExoIII 切割 THF 位點(diǎn)，使熒光與猝滅基團(tuán)分離，報(bào)告熒光信號(hào)。
特別說明：
（1） 以上 RPA 擴(kuò)增測試屬于蛋白功能性測試，按照以上實(shí)驗(yàn)操作流程，可獲得 RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物。進(jìn)一步的優(yōu)化，包括：X、Y、GP32、聚合酶、反應(yīng) Buffer，甚至加樣順序，均可能進(jìn)一步提高 RPA 的擴(kuò)增性能。
（2）關(guān)于 DNA 聚合酶的選擇， 測試了三種常見的 DNA聚合酶，在進(jìn)行熒光法測定時(shí)，推薦的選擇順序依次為 Bst 4.0>Bsu> Sau，且在 42℃條件下，總能獲得最快的擴(kuò)增速度，且熒光信號(hào)更強(qiáng)。在 Basic 擴(kuò)增中 Sau 表現(xiàn)出特異性擴(kuò)增能力更佳。
（3）關(guān)于 RPA 的靈敏度與非特異擴(kuò)增，在 Basic 試劑的擴(kuò)增中，仍然存在非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，這需要進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)組分及引物序列。在使用熒光探針法時(shí)，但由于特異性探針的存在，非特異擴(kuò)增產(chǎn)物通常無熒光信號(hào)值，但此時(shí)會(huì)影響檢測靈敏度。GP32 蛋白的
濃度增加會(huì)顯著降低非特異性擴(kuò)增，但會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增速度減緩，此時(shí)需要同步增加 X 與 Y 蛋白的用量，以維持 RPA 的擴(kuò)增速度。
（4）據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在進(jìn)行試紙條 RPA 實(shí)驗(yàn)時(shí)，傾向使用 Nfo 內(nèi)切酶又名 Endonuclease IV， 來對(duì)擴(kuò)增探針進(jìn)行切割，但  未予測試，目前無法提供相應(yīng)參數(shù)。
（5）RPA 反應(yīng) Buffer 對(duì)擴(kuò)增至關(guān)重要，輕微的濃度差異，均可導(dǎo)致擴(kuò)增效率大幅下降，甚至失敗。RPA BufferMix 為粘稠試劑，使用時(shí)務(wù)必保證加樣準(zhǔn)確，Tip 頭中的殘液務(wù)必打入 EP 管中。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對(duì)于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對(duì)PCR造成影響，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：